PRRSV感染性cDNA克隆的一步组装及一种简便的基于CRISPR/Cas9的PRRSV基因组编辑技术
发布时间：
2023-12-08
1.前言
PRRSV主要导致妊娠母猪流产和各年龄段猪的呼吸困难，给全球养猪业带来巨大负担。但是目前还没有针对PRRSV的有效疫苗和特异性药物，因此，从基因上深入研究PRRSV的致病机理，开发新一代增强型疫苗是非常必要的。
传统的反向遗传系统依赖于特定的限制性内切酶或同源重组，耗时较长以及某些基因缺乏适当的限制性内切酶限制了反向遗传系统的应用。CRISPR/Cas9是一种源于细菌的新的基因编辑技术，显著增加了基因修改位置的选择自由度，更节省时间。
本研究首次利用限制性内切酶BstXI一步组装的方法构建了PRRSV WUH3株感染性全长cDNA克隆，成功地挽救了重组病毒WUH3。随后，利用CRISPR/Cas9技术对PRRSV基因组进行编辑。通过将绿色荧光蛋白(EGFP)基因插入到PRRSV基因组中或将其nsp1α的赖氨酸(K)突变为谷氨酰胺(Q)，获得了两种重组病毒：rPRRSV WUH3-EGFP和rPRRSV WUH3 nsp1α-K150Q。为PRRSV基因组的操作提供了一种高效、方便、基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术。
2.研究内容
2.1 PRRSV WUH3全长感染性cDNA克隆的组装
根据限制性内切酶BstXI位点，将PRRSV WUH3全长基因组分成6个片段，F1到F6（图A）。同时，克隆了6个病毒片段(F1至F6)(图B)。随后，将F1和F6片段与修饰的pCMV载体融合，形成F6-pCMV-F1(图C)。将F2至F5和F6-pCMV-F1片段连接到克隆载体PCE-BLUNT中，并进行Sanger测序。
经T4连接酶连接后，构建了PRRSV WUH3感染性全长cDNA克隆(pCMV-WUH3)。最后，使用带有BstXI的限制性片段长度多态性（RFLP）对pCMV-WUH3进行了验证(图D)。
2.2 重组PRRSV WUH3的回收、鉴定及特性研究
用IFA证实了PRRSV-N蛋白的表达(图A)。rPRRSV WUH3株的滴度在24 h后略高于PRRSV WUH3株，但在48 h时两株病毒的滴度均达到最高(图B)。此外，rPRRSV WUH3形成的斑块大小与PRRSV WUH3相似(图C，D)。
2.3 携带外源基因的CRISPR/Cas9对PRRSV基因组的修饰
利用CRISPR/Cas9将EGFP基因插入到PRRSV WUH3株ORF1b和ORF2之间(图A)。设计了针对ORF1b或ORF2的sgRNAs并合成。sgRNA-ORF1b和sgRNAORF2切割pCMV-WUH3质粒。结果表明，Cas9/sgRNAs复合体特异性地将pCMV-WUH3切割成约1.2kb的DNA片段(图B)。然后，通过同源重组将EGFP基因连接到pCMV-WUH3上，形成pCMV-WUH3-EGFP，并进行Sanger测序(图C)。
2.4. 重组PRRSV WUH3-EGFP的拯救及其特性
结果表明，pCMV-WUH3-EGFP和pCMV-WUH3均能表达PRRSV-N蛋白，而仅转染pCMV-WUH3-EGFP的细胞中可检测到EGFP表达 (图A)。且只在转染pCMV-WUH3-EGFP的细胞中可以观察到由EGFP发出的绿色荧光 (图B)。与rPRRSV WUH3相比，在所有测试时间点观察到rPRRSV WUH3-EGFP的滴度略低(图C)。此外，rPRRSV WUH3-EGFP病毒在Marc-145细胞中显示出与rPRRSV WUH3相似的空斑大小(图D，E)。这些结果表明CRISPR/Cas9能有效地将外源基因插入到PRRSV基因组中。
2.5 CRISPR/Cas9用于PRRSV基因组的定点突变
PRRSV WUH3nsp1α存在潜在的泛素化修饰位点，第150位赖氨酸(K)残基。NSP1α中的K150在NA-PRRSV中主要是赖氨酸(K)，在EU-PRRSV中主要是谷氨酰胺(Q)。因此，计划在PRRSV WUH3 nsp1α中将K150突变为Q150。
首先，我们合成了两个针对NSP1α的sgRNA，在这些sgRNA的指导下，Cas9在nsp1α的K150附近的两个相邻位置上切割了pCMV-WUH3。然后，利用同源重组，形成pCMV-WUH3 nsp1α-K150Q，Sanger测序(图A，B)。将pCMV-WUH3-NSP1α-K150Q导入MARC-145细胞，获得重组PRRSV WUH3-NSP1α-K150Q，出现CPE。免疫荧光分析证实，pCMV-WUH3 nsp1α-K150Q表达PRRSV-N蛋白(图C)。
Sanger测序确认突变K150Q(D)。rPRRSV WUH3 nsp1α-K150Q和rPRRSV WUH3具有相似的生长动力学，并在48hpi时达到增殖高峰(图E)。且空斑大小没有显著差异(图F，G)。
3 结论
本研究建立了一种简便的基于CRISPR/Cas9的PRRSV基因组操作方法。它可以用于将外源基因插入病毒基因组，也可以精确地突变病毒基因。这种便捷的方法必将推动未来增强型疫苗的发展，加速病毒致病机理的研究。
Key words：
