利用CRISPR-Cas12a一步法可视检测非洲猪瘟病毒
发布时间：
2023-12-08
非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的家猪高致死率和传染性疾病，被世界动物卫生组织(OIE)列为法定传染病。非洲猪瘟具有高传染性和高致死率，严重影响了畜牧业的健康发展。因此，研发一种准确、灵敏、高效和可现场检测的方法对于疾病监测和控制非常重要。
最近，由成簇、规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关核酸内切酶CRISPR/Cas系统被开发用于核酸检测。CRISPR检测是由靶标核酸激活Cas蛋白的反式切割活性，将体系中的荧光标记探针切碎，发出荧光信号，完成核酸检测的过程。
本篇文章采用CRISPR/Cas12a技术，结合等温预扩增LAMP或RPA技术，构建了非洲猪瘟病毒一步法可视检测系统。将RPA或LAMP预扩增试剂加入离心管中，在预扩增试剂上覆盖35µL矿物油。待RPA或LAMP反应结束后，将20µL的CRISPR反应缓冲液(预先加在管盖内)与25µL的扩增试剂用手摇匀。将试管于37℃，放置20 min，在蓝光下用透照器观察裂解反应后的荧光信号。
首先，该研究进行CRISPR-RPA一步法检测反应时间的优化，发现荧光信号在20 min时，肉眼可以清晰观察到。在65℃下孵育不同时间，发现LAMP的合适预扩增时间是40min，CRISPR反应的最佳时间是20min。这表明CRISPR-RPA一步法检测的反应时间为40 min，CRISPR-LAMP一步法检测反应时间共60 min。
随后，在加入模板DNA孵育后，pUC57-p72 DNA出现了强烈的荧光信号，而其他基因组DNA或cDNA没有荧光信号，这表明CRISPR-RPA/LAMP一步法可视检测可用于特异性检测ASFV。
CRISPR-RPA检测系统使用10倍连续稀释的pUC57-p72 DNA作为模板测定反应的灵敏度，发现CRISPR-RPA可以检测低至7 × 104copies/µL的dsDNA模板。CRISPR-LAMP检测系统使用10倍连续稀释的pUC57-p72 DNA作为模板测定灵敏度，结果显示，CRISPR-LAMP可检测低至7 × 102copies/µL的dsDNA模板。使用稀释后的ASFV B646L基因质粒标准物质为模板，CRISPR-LAMP系统在60 min内的检测限为5.8 × 102copies/µL。
最后，将CRISPR-LAMP与最常用的检测方法定量qPCR进行了比较，结果显示，qPCR检测限为7×102 copies/µL，CRISPR-LAMP可达到5.8 × 102copies/µL的灵敏度。总之，CRISPR -RPA/LAMP是一种快速、灵敏、特异、无设备、低成本的ASFV检测方法。
参考文献：Qin C, Liu J, Zhu W, et al. One-Pot Visual Detection of African Swine Fever Virus Using CRISPR-Cas12a. Front Vet Sci. 2022 Jul 18;9:962438.
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