用于非洲猪瘟病毒基因免扩增检测的CRISPR/Cas12a-SERS平台
发布时间：
2023-12-08
1.研究背景
非洲猪瘟病毒（ASFV）是一种对猪具有高度传染性和致命性的病原体，被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的动物传染病之一。因此，开发一种快速、特异和敏感的方法来检测ASFV极其重要。
CRISPR/Cas12由于其独特的反式切割特性而表现出高灵敏度。Cas12a是一种crRNA（pre-CRISPR RNA）导向的 DNA 核酸内切酶，可特异性识别目标 dsDNA。CRISPR/Cas12a 的核酸检测系统可以采用基于荧光活性探针的裂解的策略，该探针含有猝灭剂和由 ssDNA 桥接的发色团，当 Cas12/crRNA/目标 DNA 作用于 ssDNA 时，将观察到荧光“开启”。表面增强拉曼光谱（SERS）具有丰富的光谱指纹和超高的灵敏度等优点，已在生物监测中受到了广泛的应用。
本研究提出了一种结合 CRISPR/Cas12a 系统的 SERS 方法，用于 ASFV dsDNA 的生物测定。
2.研究内容
本文提出表面增强拉曼散射 (SERS) 策略与 CRISPR/Cas12a 系统相结合，旨在用于非洲猪瘟病毒 (ASFV) 的无扩增基因检测。
本文研究将 SERS 标签固定在磁珠 (MB) 上方，并以 ssDNA 作为连接子，设计并制备了复合 SERS 传感探针（方案1. a）。其中，尺寸为50 nm的银纳米粒子被拉曼报告分子（4-巯基苯甲酸，4-MBA）修饰形成SERS标签，并使用链霉亲和素功能化磁珠（MB，300 nm）。实验设计了具有双末端（生物素和巯基）的单链DNA，其充当目标双链DNA激活的Cas12a蛋白的切割底物。（方案1. b）。当目标 dsDNA 存在时，Cas12a 蛋白就可以被激活，启动针对 dsDNA 和 ssDNA 的反式切割功能，SERS 标签将离开 MB 进入溶液中，使用磁棒收集这些 MB 进行 SERS 测量，会提供微弱的 SERS 信号。如果没有测试目标 dsDNA 或不匹配的 DNA，那么大多数 SERS 标签完整地固定在 MB 表面上，传感平台则将产生强烈的 SERS 信号（方案1. c）。
本文研究通过琼脂糖凝胶电泳实验进行了crRNA与ASFV dsDNA的亲和力和鉴定。凝胶电泳数据表明 ASFV dsDNA 已被 Cas12a 切割，可证明 dsDNA和crRNA序列适用于CRISPR/Cas12a系统，并且它们可以触发Cas12a蛋白的切割功能。（图1.A）
本文研究使用非靶基因（KRAS dsDNA）作为测试CRISPR/Cas12a-crRNA的对照。试验结果显示对照条带没有变化，而目标ASFV dsDNA的条带向下移动，证明目标dsDNA已被切割成片段。结果表明，根据ASFV dsDNA设计的crRNA只能识别目标dsDNA，当非目标序列存在时不具有切割能力，这证明CRISPR/Cas12a系统对于检测ASFV dsDNA具有特异性。（图1.B）
本文研究使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF-MS) 对接头 ssDNA 上的 Cas12a 反式切割作用进行验证。结果表明，ssDNA被Cas12a切割成不同大小的DNA片段，从而证明 Cas12a 被 crRNA 和目标 ASFV dsDNA 激活后，Cas12a 对 ssDNA 具有无限切割特性。（图1.C）
本文研究制备了传感探针 AgNPs/4-MBA/ssDNA/MB，并通过 UV-Vis 吸收光谱、 z 电位测量和 TEM 对进行了验证。AgNPs/4-MBA/ssDNA/MBs的TEM图像中可以看出合成的AgNPs呈球形，直径约为50 nm。AgNP 围绕 MB，表明 AgNP 通过连接子 ssDNA 成功连接到 MB。（图2.A）
通过激活Cas12a作用后AgNPs/4-MBA/ssDNA/MB的TEM图像，可以观察到MB上仅留下一小部分AgNP，此结果可证明连接子ssDNA已被激活的Cas12a成功切割。（图2.B）
本文研究通过检测不同浓度的ASFV dsDNA验证CRISPR/Cas12a-SERS系统的检测灵敏度。结果显示，随着ASFV dsDNA浓度的降低，MB上的拉曼信号逐渐增强，CRISPR-SERS检测到的最低浓度可以达到1.0 × 10−14 nM，对于ASFV dsDNA可以达到10 fM的检测限。（图2.C）
本文研究使用非靶基因序列（KRAS dsDNA）代替ASFV dsDNA进行SERS测量来进行特异性验证。试验数据显示，KRAS dsDNA测试中特征峰的信号强度与阴性对照（不添加dsDNA，p > 0.05）几乎没有区别，而目标基因ASFV dsDNA的特征峰信号强度显着降低，这证明CRISPR/Cas12a系统对ASFV具有显着的特异性。（图3.A、B）
本研究通过在 ASFV dsDNA 中掺入 KRAS dsDNA 进一步测试了干扰检测。当目标基因序列ASFV dsDNA与非目标基因序列KRAS dsDNA混合，对比试验为ASFV dsDNA和水的混合物，这两次试验的特征峰信号强度几乎没有差异（p > 0.05）。这些数据可证明非靶基因序列不会干扰ASFV检测，不会出现假阳性结果。（图3.C、D）
本研究建立了可用于液体活检的方法对 CRISPR/Cas12a-SERS 平台进行验证，实验将目标DNA（ASFV dsDNA片段）和非目标DNA（KRAS dsDNA片段）分别添加到热处理血清中，同时用水代替进行对照试验。结果表明，在靶DNA(ASFV DsDNA)存在的情况下，SERS信号明显减弱，而在非靶DNA(KRAS DsDNA)存在的情况下，SERS信号保持较高的强度，这证明建立的方法能够成功地识别和检测血清中的核酸。（图4.A、B）
本文研究利用该平台检测ASF伪病毒核酸标准品来评价该方法的实际应用效果。通过病毒基因组提取试剂盒提取假病毒的DNA，提取的基因样本通过开发的CRISPR/Cas12a-SERS平台进行检测。结果表明，提取的核酸样品的加入激活了Cas12a对单链DNA的切割作用，导致SERS信号强度降低，而未提取的核酸样品具有较高的SERS信号(（图5.A、B）
3.总结
本文研究针对ASFV的现场检测和快速检测，开发了CRISPR/Cas12a-SERS系统，该系统对10fM具有高灵敏度和高选择性。磁性 SERS 纳米探针设计有连接体 ssDNA，该连接体是 Cas12a 反式切割反应的底物。ASFV检测可在2小时内完成，并已被证明对假病毒和血清样本中的 ASFV 有效。这种传感是一种无扩增方式，可以避免气溶胶的假阳性问题。
但此方法有局限性，因为它在实验过程中只能检测一种分析物，而不能同时检测多种物质。此方法为基因检测提供了一个通用平台，可以扩展到其他病毒，因此这项研究很可能用于推进体外诊断应用。
Key words：
