假病毒系统在疫苗、抗病毒药物和中和抗体研发中的应用

• 背景

假病毒通常基于生物风险较低的病毒(如鼠白血病病毒(MLV)和水泡性口炎病毒(VSV)等)或遗传修饰病毒(人类免疫缺陷病毒(human immune deficiency virus,HIV))的基因组，将感染宿主细胞所需的包膜蛋白基因替换为可用于体外检测的报告基因，如GFP和荧光素酶基因。同时使用质粒或稳定表达的细胞系表达待研究的高风险病毒的包膜蛋白。来源于两种不同病毒的核心基因组和包膜蛋白在体外组装形成一个完整的假病毒颗粒，可以分泌到细胞培养上清液中。此时，收集上清，可用于感染靶细胞。因此，假病毒可以通过利用高传染性病毒的包膜蛋白来模拟活病毒感染的过程。

假病毒具有安全性高、可操作性强、易于实现快速高通量检测等特点。因此，假病毒被广泛应用于病毒感染机制研究、单克隆抗体和抗病毒药物的筛选与评价，以及疫苗接种后血清中和抗体滴度的检测。本文将讨论不同包装系统下假病毒的构建、应用现状，特别是在SARS-CoV-2研究中的应用、局限性以及进一步的研究方向。

• 假病毒的分类

根据其核心基因组来源的不同，大致分为三种类型：

以艾滋病毒1型HIV-1基因组为核心的假病毒,

以水疱性口炎病毒VSV基因组为核心的假病毒,

以鼠白血病病毒MLV基因组为核心的假病毒。

1. HIV包装体系

HIV基因组包含3个结构基因(gag、pol和env)、3个调节基因(tat、rev和nef)和4个辅助基因(vif、vpr、vpu和vpx)，为了减少体外同源重组形成完整HIV的机会，删除HIV基因组一些可有可无的元件，如nef等，将HIV基因组的不同部分克隆到不同的表达载体中。同时，为装载其他病毒的包膜蛋白，包膜蛋白基因env会发生移码突变或缺失。因此，需要另一种异源表达包膜蛋白的质粒才能形成基于HIV的假病毒。

HIV病毒基因组：Sakuma T, Barry MA, Ikeda Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochem J. 2012;443(3):603-618.

注：

gag--编码病毒核心蛋白，包括基质蛋白、衣壳蛋白和核衣壳蛋白等；

pol--编码病毒复制所需的酶，如反转录酶、整合酶和蛋白酶；

Env--编码包膜蛋白，决定病毒感染宿主的靶向性；

Tat--基因反式激活因子，与病毒的LTRs结合后促进病毒基因的转录；

rev—病毒蛋白表达调节因子，调节gag、pol和env的表达水平；

vif,vpr,vpu和nef这4个辅助因子，编码的蛋白作为毒力因子参与宿主细胞的识别和感染；

LTR--长末端重复序列（long terminal repeat）内含复制所需的顺式作用元件；病毒基因转录启动子；对慢病毒的转录、逆转和整合进入宿主细胞基因组都是必须的。

Ψ--位于5'-LTR和gag基因之间，是病毒基因组二聚化和包装的必须信号。

根据使用的质粒数量，HIV假病毒系统可分为双质粒系统、三质粒系统和四质粒系统。

双质粒系统包括一个表达质粒和一个包装质粒。常用的包装质粒为pSG3Δenv和pNL4-3。

三质粒系统是在双质粒系统的基础上，将HIV骨架分为包装质粒和转移质粒。

包装质粒有CMV强启动子、gag、pol和调节蛋白以产生病毒颗粒。

包膜质粒用VSV-G代替Env。(Env表达病毒糖蛋白，如VSV-G，为载体颗粒提供受体结合蛋白)

转移质粒含有HIV逆转录酶基因、整合所需的顺式调控元件以及CMV启动子驱动的报告基因。常用的包装质粒和转移质粒有psPAX2和pLenti-GFP。

Sakuma T, Barry MA, Ikeda Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochem J. 2012;443(3):603-618.

第二代包装系统删除了Vif、Vpu、Vpr和Nef四个辅助基因以减少HIV毒力传播。加上用VSV-G取代HIV-1的env，第二代只包含了HIV-1的9个基因中的4个：gag、pol（结构）；tat、rev（调控）。第二代在第一代的基础上，又提高了安全性。转移质粒包含病毒LTR和ψ包装信号。若不提供内部启动子，基因表达将由5’LTR驱动，5’LTR是弱启动子，需要提供tat才能激活表达，正因如此，第二代转移质粒必须与第二代包装系统一起使用。

四质粒系统在三质粒系统的基础上进一步将rev分离成独立的表达质粒，即将包装质粒分成了两个，一个编码rev，另一个编码gag和pol。tat调节基因也被剔除，对5’LTR进行了改造，换上了异源启动子，从而不需依赖tat基因，所以第二代或第三代包装系统能够包装第三代转移质粒。减少HIV体外重组的机会，进一步提高安全性。

第三代包装系统（四质粒）：

Sakuma T, Barry MA, Ikeda Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochem J. 2012;443(3):603-618.

小结：包一个完整病毒，一般需要以下几个质粒：

1个穿梭质粒：这个就是在两端LTR区域携带我们目的基因，但它是复制缺陷型的，所以还需下面的辅助质粒；

1个到2个包装质粒；

1个包膜质粒。

通过将上述质粒转染293T细胞，包装质粒和载体质粒转录的HIV基因组元件被组装成不完整而安全的HIV假病毒颗粒，病毒颗粒通过胞吐作用分泌到细胞外区域。在分泌过程中，假病毒颗粒会趁机将异源表达的包膜蛋白整合到病毒膜上。最后，收集细胞上清液，通过离心、纯化、浓缩得到假病毒，以供后续研究。

2. VSV包装体系

VSV是一种有包膜的RNA病毒，主要感染动物。VSV基因组为不分节段的单股负链RNA(ssRNA)，大小约11kb，编码5种不同的主要蛋白，包括核蛋白(N)、磷酸化蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和RNA聚合酶蛋白(L)。由于其基因组结构简单且易感染多种动物细胞，VSV也被认为是一种理想的病毒工具。

合成VSV假病毒主要有三步：1. 用质粒初步制备VSV；2. 扩增G糖蛋白补全的VSV；3. 使用异源病毒的包膜蛋白组装VSV假病毒。

制备重组VSV时，首先需构建能转录VSV基因组的负义RNA的VSVΔG转移质粒，其转录产物作为RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)合成病毒RNA的RNA模板。将该载体与分别表达VSV N，P，G和L蛋白的四个辅助载体共转染到经牛痘病毒接种的表达噬菌体T7 RNA聚合酶的包装细胞中。重组VSV在包装细胞中组装并释放。

收集细胞上清液，以获得G缺陷型VSV病毒。之后用上清重新感染表达G糖蛋白的包装细胞，获得高量的VSV-ΔG/G*。

再利用VSV-ΔG/G*病毒粒子感染表达有异源病毒包膜蛋白的包装细胞，产生目的假病毒。但是初始病毒颗粒的G蛋白可能会在新产生的颗粒上循环，这可能会导致较高的背景噪声。因此使用针对G蛋白的抗体对这类假病毒至关重要。

3. MLV包装体系

鼠白血病病毒MLV也是一种逆转录病毒，主要感染小鼠并引起白血病。MLV是一种有包膜正链RNA病毒，基因组约8000bp，包括三个结构基因(gag、pol和env)，编码病毒衣壳蛋白[基质(MA)、衣壳(CA)和核衣壳(NC)]、蛋白酶[逆转录酶(RT)、整合酶(IN)和蛋白酶(PR)]和包膜蛋白。

MLV假病毒的包装过程与HIV类似。通过质粒转染的方法将MLV结构基因gag和pol以及一个编码异源病毒包膜蛋白的基因转染到细胞中。在细胞内重组后，携带异源病毒包膜蛋白的假病毒颗粒会被分泌到细胞培养基中。

• Sars-Cov-2假病毒的应用

目前，SARS-CoV-2假病毒在病毒入侵机制研究、抗病毒药物筛选、疫苗效价评估、中和抗体能力测定等方面发挥了重要作用。

在病毒入侵机制研究方面：霍夫曼等利用SARS-CoV-2S假病毒颗粒证明血管紧张素转化酶2(ACE2)和跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)对于SARS-CoV-2的进入人体是必不可少的，Mandel克洛桑等也利用VSV假病毒系统发现硫酸乙酰肝素对于增强Spike与ACE2的结合具有重要意义。

在抗病毒药物筛选方面：魏等利用HIV SARS-CoV-2假病毒证明了高密度脂蛋白B族Ⅰ型清道夫受体(SR-B1)促进ACE2依赖的SARS-CoV-2进入。

He等利用荧光素酶表达的编码SARS-CoV-2VS(G614)蛋白的假病毒，从188种天然化合物中鉴定出9种活性较高（EC50<10μM）、细胞毒性低（CC50>20μM）、特异性强（SI>10，VSV-G EC50>20μM）的候选抗病毒药物。

Yang等利用刺突蛋白假型HIV病毒颗粒对SARS-CoV-2病毒进入抑制剂进行了高通量筛选。从已批准的包含1800个小分子药物的药物库中，确定了15个有效药物为SARS-CoV-2假病毒的特异性进入抑制剂。

在疫苗效力评价方面：无论是临床前阶段还是临床阶段，通过假病毒中和试验测定疫苗接种后血清中的中和抗体都是必不可少的实验。四川大学研发的SRBD亚单位蛋白疫苗、Novavax公司研发的全长S糖蛋白疫苗、辉瑞和Moderna的mRNA疫苗、强生公司和牛津大学研发的腺病毒载体疫苗以及科兴生物和北京生物制品研究所研发的灭活疫苗在内的多款疫苗，均采用假病毒系统评价疫苗接种后诱导产生的抗体的中和能力。Ju等进一步报道了从8例SARS-CoV-2感染者的单个B细胞中分离并鉴定了206株RBD特异性单克隆抗体，并利用HIV假病毒系统检测了这些抗体的中和能力，其中多株抗体的IC50小于1ug/ml。更多SARS-CoV-2假病毒的应用实例见表1。

此外当病毒表面的糖蛋白发生重要突变时，可以提高传播能力，促进免疫逃逸，并且难以分离出突变的活病毒株，科学家可以快速利用基因编辑技术对野生型包膜蛋白进行定点诱变，以获得假病毒中的单点或多点突变来研究其功能。例如在COVID-2020大流行期间，世界各地出现了多种SARS-COV-19突变株，每个新的突变株的出现都引发了新一波疫情，引起了广泛关注。部分突变体及其突变位点如下图所示，基于此，科学家们迅速构建了一系列含有单点突变或多点突变的SARS-COV-2S蛋白的假病毒，并确定了这些突变体相对于野生型的影响。

• 假病毒的优势与局限性

综上所述与自然源性病毒相比，假病毒感染系统主要具有以下优势∶

首先，具有单轮感染特性，生物安全性较高。假病毒核酸分子上编码囊膜蛋白的基因被修饰掉，因此不具备自我复制能力，只能进行单一周期的侵染，不能再组装成病毒颗粒。

其次，在系统中可引入报告基因，便于检测和分析。可引入的报告基因主要有萤火虫荧光素酶（LUC）、绿色荧光蛋白（GFP）等，便于进行定性和定量分析。

最后，制备过程相对简单快速，降低了病毒变异，减少了检测时间。

宿主范围广泛、易被浓缩成高滴度、稳定性及转染效率高。

假病毒的局限性

首先，假病毒只能用于研究具有特异性囊膜蛋白的病毒，如流感病毒、冠状病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、黄病毒、埃博拉病毒等。然而，假病毒系统对于没有囊膜蛋白的病毒，如轮状病毒、脊髓灰质炎病毒等，很难发挥作用。

其次，与活病毒相比，假病毒模拟的特征也非常有限。假病毒在很大程度上只能模拟活病毒的包膜蛋白在体外介导病毒进入细胞的作用，而无法模拟病毒进入细胞后的增殖和释放过程。

此外，病毒颗粒的形状可能会影响所构建的假病毒的适用性。例如，SARS-CoV-2为球形病毒，S蛋白在融合前后有两种不同状态。然而在我们常用的假病毒体系中，HIV-1和MLV是球形病毒，而VSV是弹状病毒，S蛋白在假病毒表面的分布并不清楚。因此，假病毒表面异源病毒糖蛋白的分布、构象和密度模式可能无法反映其在活病毒表面的“自然"状态。

最后，假病毒滴度的定量计算不方便，研究者在使用HIV包装假病毒时，会选择用ELISA方法检测HIV-1p24抗原的水平来定量假病毒的滴度。用逆转录qPCR测定的每毫升病毒原液中病毒RNA基因组数来表示假病毒拷贝数。其他滴度定量方法包括用Reed-Muench法计算TCID50以及用反转录qPCR测定样品的拷贝数并与标准品进行比较。然而，用ELISA方法检测p24抗原或qPCR测定拷贝数忽略了一个问题，即它们测量的是假病毒核心基因组的数量。而假病毒的包膜蛋白数量与核心基因组的拷贝数并不成正比。有时假病毒外膜可能无法成功装载包膜蛋白。滴度可以通过P24或qPCR进行测定，这些方法计算的滴度失去了真实性，特别是在比较不同突变体S蛋白对病毒感染能力的影响时。TCID50法考虑了包膜蛋白的因素，但仍存在另一个问题：即使在感染单位相同的情况下，不同感染能力的突变体之间膜蛋白的量也可能不一致。例如，有研究表明，与WT相比，S蛋白上的L452R突变会提高假病毒的感染能力。

因此，使用假病毒的检测结果应该与活病毒的检测结果进行比较和验证，后者仍然是金标准。